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货号:Cat. No. T90805-1   Size: 1ml
货号:Cat. No. T90805-9   Size: 9ml 
—— 产品介绍
    本产品是在本公司第二代即用型PCR试剂盒G2.0的基础上改良而来,内含Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR增强剂、上样染料等所有PCR所需要的成分,用户只需加入模板和引物即可进行PCR反应,具有广泛的用途。
—— 产品特色
1.  扩增效率和灵敏度更高。
2.  使用改良型PCR染料,与荧光PCR兼容,此染料功能类似溴酚蓝,扩增结束后无需添加上样液及电泳指示染料即可直接电泳检测。
3.  方便——用户只需准备模板和引物既可以进行PCR实验。
4.  快捷——操作步骤已经最大限度地简化,能减少污染,降低实验误差。
5.  本产品A型含电泳染料, PCR反应液可直接上样电泳,进一步简化了操作。
6.  产物可直接用于T载体克隆,不需要额外的加A反应。
7.  染料单独提供,方便客户组合。
 —— 操作步骤
    以30 uL的标准PCR反应体系为例:在一干净的PCR管中,加入下列成分:
PCR MagicMix3.0
15ul
DNA模板(自备)
 
哺乳动物基因组DNA
0.5-1 ug
酵母基因组DNA
5-500 ng
细菌基因组DNA
0.5-50 ng
质粒DNA
5-500 pg
PCR回收片段
1-100 pg
PCR引物(自备)
10 pmol each
补水到
30ul
    放入PCR仪中进行PCR,结束后取5-10 uL直接上样电泳(A型产品不需要额外再加DNA上样液),红色染料电泳速度相当于50 bp DNA片段。B型产品用户按照1.5mL PCR MagicMix 3.0加入60 uL专用染料的比例将60 uL专用染料加入到1.5 mL PCR MagicMix 3.0中。
注意:
1.如果反应体系不是30 uL,各成分需要等按比例增加或减少。
2.如果DNA模板中有PCR不明抑制物(植物、土壤和血液等DNA样品常含此类抑制物),可以在PCR体系中加入1/10的PCR抑制物清除剂,可能会对PCR有帮助。
——— 保存条件
    低温运输,-20℃保存,有效期1年。
—— 注意事项
    本产品分A和B两种:
A型产品:PCR MagicMix 3.0中直接加入了专用染料;
B型产品:PCR MagicMix 3.0中没有加入专用染料,染料单独提供。 
—— 相关专业资料
PCR反应的影响因素:
1、变性温度与时间:模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度,达不到变性温度就不会产生单链DNA模板,PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全,DNA双链会很快复性,因而减少产量。变性温度太高,又会影响酶的活性。一般情况下可设为94℃20~30秒,高温时间应尽量缩短,以保持耐热DNA聚合酶的活力,最高变性温度不宜超过95℃。 
2、退火温度与时间:退火温度决定PCR特异性与产量。温度高特异性强,但过高则引物不能与模板牢固结合,DNA扩增效率下降;温度低产量高,但过低可造成引物与模板错配,非特异性产物增加。合适的退火温度一般在45~68℃之间。设置特定反应的最适退火温度,可根据引物的(G+C)%含量进行推测,一般实验中退火温度比扩增引物的熔解温度Tm低5℃,退火时间一般为30~60秒,足以使引物与模板之间完全结合,长时间退火没有必要。 
3、延伸温度与时间:PCR反应的延伸温度一般选择在70~75℃之间,延伸时间根据所用聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定,如同样扩增2 Kb片段,若使用Taq酶只需1分钟,使用Pfu酶则应设定2分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现,时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。 
4、循环次数:可根据模板DNA的量、扩增片段的大小和扩增产物的下一步应用等因素,设定20-40个循环。循环次数太少,扩增量不足,如果循环次数太多,错配几率会增加,非特异性背景严重。所以,在保证产物得率前提下,应尽量减少循环次数。 
5、酶量:50μL反应体系可用0.5-5 U酶,酶量的选择与模板DNA的量、扩增片段大小等有关,酶量过多易发生非特异性反应,而且可能增加突变的机率,尤其在进行高保真扩增时,应尽量减少酶量,但酶量过少时反应性能下降。
6、模板:模板可以是单链DNA,也可以是双链DNA,质粒DNA的扩增效率略低于线状DNA。模板加量一般不需太多,不超过1μg为宜,因为加量过多可能导致非特异性扩增增加,但是要考虑模板中靶序列的含量。例如,使用基因组为模板扩增单拷贝或低拷贝靶序列,就需要适当加大模板用量。
7、引物:引物与模板配对的长度应至少为17个核苷酸,最高不宜超过30个核苷酸,最佳长度为20~24个核苷酸,如需插入酶切位点,应在酶切位点5’端多加几个碱基,有利于酶切。引物的(G+C)%含量组成应均匀,尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中(G+C)%含量应尽量相似。引物内部应避免形成明显的次级结构,如发夹结构。两个引物之间不应发生互补,特别是在引物3’端。如果可能,引物3’端最好富有GC,这样退火后有利于引物3’端的延伸。人工合成的引物最好经验色谱层析纯化或PAGE纯化,以除去未能合成至全长的短链等杂质。引物的终浓度一般为0.1-2μM左右,浓度太高会导致非特异性扩增,太低则扩增产物太少。

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